汇文书院的首任院长是美以美会的传教士福开森（J.C.Ferguson）。他是加拿大安大略省人，生于1866年，毕业于美国波斯顿大学，获文学士学位（1902年获哲学博士学位）。1886年新婚后的福开森，携夫人来华，先在镇江习华语，次年来南京。起初为了传教方便，在自己家中（据说在估衣廊一带，那里建有美以美会教堂），设班课徒，学生数人，传授课程以《圣经》为主，英语、数学、国学为辅，主要由福开森夫妇授课，聘请中国教师授国文。当时的教会学校大都讲授这几门课。1887年，美国教会捐款发展基督教育事业，美以美会获得一笔捐赠，适值清政府下达科举考试增设算学一科诏书的时机，遂于1888年在南京干河沿创办汇文书院。福开森便当上了首任院长。

汇文书院最早建成的校舍为一幢三层楼洋房，又称钟楼，这是福开森建造的。在满清时代，南京房屋均为矮小平房，南京市民对这三层楼建筑，视为奇观。又因是洋人所建，故时人称之为“三层楼洋行”。如叫马车或人力车去汇文书院，反不为人所知，如说去三层楼洋行，则无论远近，无人不晓。以后数年内，汇文书院又陆续添建了礼拜堂、青年会堂、教室、宿舍等，全院主要建筑有六座。

汇文书院始设圣道馆、博物馆（即文理科）。1896年增设医学馆。并设有附中称成美馆。开办时，标榜传授高级科学课程，实际上并不具备大学水准。那时学生只有5人，以后逐年增加。至1906年时，在校学生达200人。中西教员数人，穆尔（西籍）为西文总教习，垣模（西籍）为西文教习；师图尔（西籍）为医科总教习，马林、比必医士（西籍）等为医学教习；南京名儒李自芳为中文总教习，周岐山、李鉴堂为中文教习，著名书法家骆寄海亦被聘来任教。

起初，清政府官员与教会学校几乎没有什么联系。到20世纪初，由于风气的转变，上层人士对西学的兴趣渐渐浓厚起来，教会大学便越来越引起人们的注意。汇文书院也开始与地方官员有所接触。学校每年学生毕业，虽然人数寥寥，都要隆重举行毕业典礼。这时，地方官员应邀出席学校的毕业典礼或其他仪式，两江总督端方、张人骏以及大小文武官员都曾被邀请到场。这一日成为学校的一个盛大节日，戴大红顶子、水红顶子、蓝顶子、水晶顶子以及铜顶子的官员占满礼堂，双马马车、单马马车、轿子、仪仗马及开气袍子的官员挤满校园。学校及毕业生都感到荣耀。

1896年，福开森应清政府官吏盛宣怀之聘，出任南洋公学（即上海交通大学前身）监院，辞去汇文书院院长职务。三年后，他先后在上海办《新闻报》、《英文时报》、《亚洲文荟》。后来，又充任两江总督刘坤一的顾问。北洋军阀时期，他与军阀官僚来往密切，任北洋政府的顾问，直接参与中国的政治活动。当时，像福开森那样从政的传教士很多，他们来中国传教的目的，就是试图“从更大的范围控制中国”。福开森离校后，一直与金陵大学保持密切联系，并担任校董会的董事。

继福开森之后，由汇文书院医科总教习师图尔（G.A.Stuart）（《金陵大学1922年同学录》，见《金陵大学史料集》第9页，1989年版。）接任院长职务（1896～1907）。

师图尔是美国东部马利兰人，出身于传教士家庭。他获得美国哈佛德大学医学博士后，于1888年携其夫人来华。始在南京任传教士。二年后去安徽传教，创办弋矶山医院。1896年应聘汇文书院。遂设医学馆。属美以美会董事会，是各教会合办的一个事业。师图尔任医学馆总教习。

19世纪末，在汇文书院创设医科之前，南京便有两处教会办的医院：一是基督医院，创办人是1886年受英国基督教派遣以基督会会友身份来华的传教士麦克林（William Eaward Maoklin）医士。（《南京史誌》1987年第1期。）他是多罗多大学医科学士，产外科会会员（相当于美国博士）。来华后自取中国名马林，在南京鼓楼附近创办基督医院，即今鼓楼医院的前身；一是金陵医院，创办者是比必博士（Rebert Case Beebe）。他是美国西北大学医科博士，1884年以美以美会会友身份来华，1885年在南京汉西门创办金陵医院（西名Phliander Smith Memorial Hospital）。他俩在“刀圭之余，招收门徒，设帐讲学”。师图尔在南京传教时，与他俩交往甚密。师图尔主持汇文书院医科后，便与马林、比必博士合作，共同培养医学人才，“集两门弟子于一炉共铸之”。医科的教学工作即由他们三人分担，再聘若干助教员。基督、金陵两医院便成为医科的实习医院。从1896～1909年，医科共培养毕业生13人。大都在苏南和皖南一带行医。

师图尔长院10年期间，致力于课程改革，聘请教师，扩充校舍，对学校发展作出一定贡献。他是一位虔诚的传教士，在他主持下，宗教课程的设置很重，宗教仪式也很频繁，自己并在长老会兼职，每逢星期日必至教堂演讲。工作之余，他还努力从事《圣经》和医学方面的译著工作。一生译著甚多，最著者，如：《拍雷克利圣经之研究》、《解剖学名词表》、《医科学生之实习法》等等，皆风行一时。尤其他将李时珍的52卷《本草纲目》译成英文，被世视为珍本。

1907年，美国教会图谋南京书院之合并。而师图尔一向主张独立经营学校，对合并书院持有异议，便决意辞去院长职务，到上海任《兴华报》主撰。汇文书院医科随之停办。1911年7月师图尔在上海病逝。师图尔去职后，由美国传教士包文（A.G.Bowen）任汇文书院院长（1907～1927）。

汇文书院办学21年，大学部（1896～1909）共毕业学生80名，其中圣道馆11名，博物馆56人，医学馆13人（一说11人）。其中有成就者如：首届毕业生黄荣良，毕业后，留学美国培克大学，曾任澳洲总领事。韩安，留学美国康奈尔大学农科，归国后任农林部农业实验所所长、绥远省实业厅厅长等职。刘伯明，留学美国西北大学，获哲学博士，历任金陵大学、东南大学教授，东南大学副校长，学识渊博，载誉全国，当时有“南刘北胡”（胡适）之称。